【摘 要】 美国德克萨斯州一个肿瘤多发家族在50年间，共有10多人罹患多种恶性肿瘤，包括基底细胞癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、上颌窦癌、卵巢癌及未明确来源的癌症。在美国国立卫生研究院的关注下，多国研究人员对其家族中一个同时患有恶性黑色素瘤、先天性耳聋、部分性DiGeorge综合征的男性成员从年幼开始进行了10多年的追踪研究。最终克隆出一个位于人类基因组测序GAP中的新基因-FAM230A ，提交到了美国国家生物信息数据库，还克隆出位于患者体细胞内的杂合基因和蛋白，并发现了一些新的调节机制。研究成果最终以《t（9；22）引发p14ARF和TBX1嵌合负调控与黑色素瘤、耳聋及DNA修复缺陷相关性》为题，发表在国际知名期刊《人类突变》2013年9期上。这一研究成果，对揭秘生命科学的奥妙做出了贡献，这一漫长的科研过程也为我们带来了多种启示。
【关键词】 基因突变 DiGeorge 综合征 肿瘤易感家族 嵌合负调控 DNA修复
科学发现有其自身客观规律，科学研究行为应该遵循自然规律的法则，按照一定的程序和科学逻辑，一步步靠近真理，逐步揭开自然现象的神秘面纱。作为科学发现的首要步骤，发现问题、提出假说是重要的开端，对自然界存在的反常现象熟视无睹是不能引发科学问题的，只有拥有敏锐的观察力和持之以恒的耐力，才有可能发现待揭示的科学问题。美国国立卫生研究院的科学家们对一个肿瘤易感家族发现的特殊病例进行了多年的追踪研究，虽然过程困难重重，但是，经过十几年漫长的艰苦努力，在数不清的科研人员的共同参与下，最终解开了科学谜团。这一过程，不仅仅昭示了科学精神，从科研体制和治学态度等方面也具有启示意义。
1 一个特殊综合征病人及其多病家族
1989年，在美国德克萨斯州的奥斯汀市，出生了一个叫克里斯托弗的男性婴儿。出生时检查发现他的右手手指远端关节挛缩和第五个脚趾的位置异常。随后的几个月里，他先后罹患过多次的耳部感染和反应性气道疾病，在生命中的第一年，每天要吸入药物治疗和使用家庭雾化器。到13个月大时，又发现他患有感音性神经性耳聋。此后，克里斯托弗还经常发生鼻窦感染。到了1996年，克里斯托弗又因为鼻息肉做了切除术。后来，由于胸部、左手臂、腿和脖子等处长有多个痣而在德克萨斯州当地医院做了切除手术，手术标本病理诊断为克拉克痣（Clark’s nevi）。2003年5月，克里斯托弗左肩部患上了带状疱疹，用泛昔洛韦治疗后痊愈，未留下后遗症。他的母亲回忆说在怀孕期间做过风疹免疫。对他的家族病史调查显示，他的父系和母系家族有显著的癌症家族史，他母亲的一个堂妹和一个表兄分别在25岁和27岁时患过基底细胞癌和黑色素瘤。他的外公在69岁时被诊断为黑色素瘤并且在77岁时因此而死亡。母亲的祖父有长期的吸烟史，在75岁时被确诊患有肺癌，母亲的祖母患有乳腺癌。母亲的一个远房表兄在不足50岁的年龄被诊断出患有肺癌。父系家族中，父亲和祖母先证者中有四个叔叔姑姑患有基底细胞癌。在上溯50年中，家族中有超过10例的基底细胞癌患者。在近20年里，有一对双胞胎叔叔还患有原发灶不明的癌症，父亲的一个叔叔 在55岁时患上颌窦癌，父亲的一个姑姑患卵巢癌，另一个姑姑患未明确来源的癌症[1]。
这是一个不幸却又幸运的男孩。自从出生伊始就受到美国得克萨斯州当地医疗机构的细心照看和诊断治疗，14岁时被推荐到美国国立卫生研究院（NIH， National Institutes of Health ）接受诊疗，从此，克里斯托弗以及他的一家人受到更为严密的医学观察、观察与治疗。2003年冬季时，克里斯托弗是美国德克萨斯州奥斯汀市一所聋哑学校9年级学生，学业优秀，广受好评。21岁时他因成绩优异，获得了到美国国会做实习生的机会。
2 重要的科学意义待揭示
2003年，鉴于其特殊复杂的病情，克里斯托弗被转到美国国立卫生研究院皮肤科及DNA修复实验室主任克雷默博士（Kenneth H. Kraemer）那里做进一步的诊疗。皮肤检查发现他的胸部，背部和头皮有色素丘疹，左耳后有一个色素性斑块，病变边界不规则。克雷默博士邀请美国军队医院病理研究所的病理学家David Busch博士对病理切片进行审核，诊断为恶性黑色素瘤，并由美国空军医学研究所外科主任（Air Force Surgeon General）华敦德博士（Daniel Wattendorf）给予手术切除。美国国立耳聋及交流障碍研究所耳鼻喉科（Otolaryngology Branch，NIDCD）的听力研究室主任Carmen Brewer博士和Chris Zalewski博士， 对克里斯托弗进行了听力检测和评估，诊断为双侧听力缺失及前庭反应丧失。美国国立卫生研究院放射影像中心（Radiology Branch，Clinical Center）的John A. Butman博士为他做了MRI检测，结果显示双侧对称性耳蜗发育不全及前庭缺失。染色体检测结果显示9号和22号染色体之间存在平衡易位。NIH心肺研究所V.Sachdev博士对克里斯托弗进行了心血管检查，包括超声心动图、心脏磁共振成像。超声心动图发现克里斯托弗主动脉根部轻度扩张，主动脉瓣反流。尽管如此，克里斯托弗有没有心脏病症状，他的身体状况可以正常参与各种体育活动。五官科检查显示有部分典型的迪格奥尔格综合征（DiGeorge’syndrome）特征，如颌骨狭窄、小耳廓、低耳位、人中短等。DiGeorge综合征为非遗传性，无家族性，由于胚胎期第三、第四咽囊发育障碍，使胸腺和甲状旁腺缺如或发育不全而引起先天性异常，该异常的产生可能与胎儿母亲子宫内某种变异相关，罹患该病的患儿常伴其他先天性畸形，本综合征是多基因遗传性疾病，染色体22q11区域缺失是主要原因。另外，他还有手指挛缩，第五脚趾畸形后置。家族遗传研究显示，克里斯托弗的父母和他的哥哥没有携带染色体易位。他的父系和母系均有显著的肿瘤家族史。
经过全面详细的检查，NIH给克里斯托弗的诊断是：（1）恶性黑色素瘤；（2）先天性耳聋；（3）部分性DiGeorge综合征。
在欧美一些国家，黑色素瘤的发病率很高：黑色素瘤是澳大利亚的第一大肿瘤；在美国，每年有25000个恶性黑素瘤新增病例，年死亡约6000人，近年发病率呈急速上升趋势。但是分子病因学却不甚明了。先天性耳聋是常见致残性疾病之一，新生儿中双侧先天性耳聋发生率约在1-3‰，在目前可筛查的出生缺陷中发病率最高，已成为全球关注的重大公共卫生问题。先天性耳聋的病因主要有遗传因素和内耳正常发育异常造成。但是导致发育异常的基因迄今不明。DiGeorge综合征由于胚胎期发育障碍，使胸腺和甲状旁腺缺如或发育不全而引起先天性异常。
综合以上的诊断，NIH的科学家们意识到这是一个非常罕见而珍贵的综合病例。如果能够在克里斯托弗的体细胞中找到9号和22号染色体之间互换的准确定位，很可能会发现与黑色素瘤、先天性耳聋以及DiGeorge综合征相关的基因，从而在这三种疾病的预防和治疗工作中起到重要作用。
3 满怀信心起步 两度受挫
为了定位9号和22号染色体之间的断裂位点，2001年当克里斯托弗12岁时，克雷默博士和他的研究小组首先建立了克里斯托弗体细胞和淋巴细胞株，进一步用全染色体涂抹探针（whole chromosome painting probe，WCP），确定了9号和22号染色体的位置互换并排除合并其它染色体之间互换或丢失的可能。并用9号和22号染色体特异性探针进行荧光原位杂交，进一步定位两条染色体的断裂点位于9号染色体短臂2区1带（9p21）和22号染色体长臂1区一带（22q11.2）。这引起了研究人员更大的兴趣。因为9p21含有三个家族性黑色素瘤基因-细胞周期依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）和2B（CDKN2A）[2]。而DiGeorge综合征又称22q11.2缺失综合征，即DiGeorge综合征病人的体细胞中经常缺失22q11.2区。但是，由于9p21和22q11.2区分别在9号染色体和22号染色体上横跨19万个碱基对和300万个碱基对，分别含有3个基因和大约60个基因，要确定究竟是哪个基因与克里斯托弗所携带的综合征有关简直是大海捞针。由于当时的实验技术和相关知识的局限性，没有可行的研究手段来完成这一目标，研究工作就此搁浅。
在此期间，克里斯托弗罹患的特殊综合征在世界范围内引起了多位科学家的极大关注。2005年，日本药品与医疗器械管理局（PMDA，Pharmaceuticals and Medical Devices Agency）的上田（Takahiro Ueda）博士应约来到克雷默博士的研究室，试图根据以往文献报道的黑色素瘤、耳聋和DiGeorge综合征相关的基因以及人类基因组计划所公布的这两个区域的基因，挑选出最有可能的断裂基因。经过两年的努力，发现克里斯托弗的体细胞对紫外线引起的DNA损伤修复能力只有正常人的四分之一，对断裂点分析几乎一无所获，研究工作陷入迷茫无助之中。
4 拓展思路 几经挫折不气馁 渐露端倪
2007年7月，中国访问学者谭晓晖博士从北京大学临床肿瘤学院分子肿瘤学实验室来到了克雷默博士的皮肤科及DNA修复研究室。带着对这个课题的浓厚兴趣，她开始了极为艰辛的探索研究。首先，她阅读了几乎所有可以查阅到的关于黑色素瘤，先天性耳聋以及DiGeorge综合征有关的文献报道，调出美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库的相关基因。经过与克雷默博士多次交流讨论，她决定通过高分辨率的基因芯片比较基因组杂交（array comparative genome hybridization，aCGH））技术来寻找断裂点。他们与NIH的肿瘤分子遗传学主任Paul Meltzer博士和Sarah Anzick博士合作首先提取了克里斯托弗淋巴细胞和成纤维细胞中的DNA，用荧光素标记DNA，与芯片上探针充分杂交后，用微阵列每个靶点上的两种信号的荧光比例比较DNA在相应的序列或基因上的拷贝数变化来确定断裂点。令人失望的是，首次实验没有检测到任何有价值的变化。即便是他们用最高分辨率的芯片也不能得到任何可用的资料。他们一度认为基因芯片比较基因组杂交不能帮助检测克里斯托弗染色体异常。研究工作再度陷入停滞阶段。
带着对科学奥秘的执着的探索欲望，谭晓晖博士继续广泛阅读了大量关于比较基因组杂交技术的文献，并重新审阅了克里斯托弗以前的核型分析。她注意到克里斯托弗的核型分析图里是杂合性的，即每对9号和22号染色体中各只有一条发生了互换，而还各有一条是正常的。这一现象让她突然意识到，比较基因组杂交的阴性结果会不会由于那两条没有互换的9号和22号染色体与互换的染色体掺杂在一起使掩盖了丢失了的基因信号？如果能把互换的9号和22号染色体与正常的染色体分离开来，很可能就会得到比较基因组杂交的阳性结果！她兴奋地与克雷默博士讨论她的假设，克雷默博士非常赞同她的想法。
有了合理的假说，下一步工作就是怎样分离异位的与正常的染色体。研究组设计用显微切割或染色体流式分选的方式去分离细胞内的染色体。在NIH 遗传学科（Genetics Branch）科学家Gary Stone的帮助下，成功地分离了互换的9号和22号染色体！当他们用分选的染色体再去与芯片杂交，期待的结果来到了！利用比较基因组杂交技术能把分选的发生异位的9号染色体的断裂点定位于9p21的CDKN2A基因，断裂点打断了p14ARF 基因！尽管此前已有报道提示p14ARF 基因与黑色素瘤相关，但精确的机制还不明确。他们考虑到克里斯托弗体细胞DNA损伤修复能力降低是否由于异位的9号染色体打断了p14ARF致使该基因功能损伤引起的呢？
这个发现使得他们能够对p14ARF 基因在黑色素瘤的发生发展中的作用进行更进一步的探讨奠定了基础。于是谭晓晖博士把体外克隆的p14ARF注入克里斯托弗的体外培养的成纤维细胞里，令人惊喜的是p14ARF注入后克里斯托弗成纤维细胞的DNA 修复能力提高到了正常水平！再次敲除p14ARF后DNA 修复能力又降低原来水平。这个实验提示由于染色体异位引起 p14ARF基因断裂可能是造成克里斯托弗黑色素瘤的原因。基于这个理论，下一步就有可能研制p14ARF基因疫苗来预防克里斯托弗以及以后相同的病人再发生黑色素瘤！
可是，由于22号染色体的断裂点位于22号染色体长臂1区一带，这个区域含有各种复杂的重复序列，其中还有一个连人类基因组计划也无法检测的大约60个千碱基对序列荒岛区（GAP）。无法制备杂交探针，比较基因组杂交技术只能帮助把22号染色体的断裂点定位在890千碱基范围内。经过与NIH肿瘤分子遗传学主任梅尔泽博士（Paul Meltzer）多次探讨，谭晓晖决定先用传统的FISH 技术逐渐缩小探测范围。在随后的工作中，先后用了十几个FISH 探针，才把22号断裂点缩小在350千碱基对范围内。但是，新遇到的各种复杂的重复序列使她无法再进行检测工作，研究工作再次搁浅。
于是，谭晓晖博士又继续在文献中寻找突破点。她除了吃饭和必须的睡眠时间，把几乎所有的时间都花费在世界上最大的医学图书馆-美国国立医学图书馆（National Library of medicine，NLM），查阅了几乎所有与22号染色体长臂1区一带有关的书籍和文献。功夫不负有心人！终于她发现了几篇关于DiGeorge综合征病和22q11.2缺失相关的文献[3][4][5]。其中有几篇文献报道在克隆22号染色体长臂1区一带与其它染色体互换的文献，发现这些断裂点序列几乎相同，都存在于那个大约60个千碱基对序列荒岛区（GAP）。这个发现让她想到克里斯托弗的断裂点会不会也在这个易位热点上？她兴奋的连夜给克雷默博士发邮件阐述自己的想法。克雷默博士非常赞同她的设想。为了证实自己的假说，她参照以往文献序列用了几百对引物对克里斯托弗的DNA进行PCR扩增。但是由于周围的重复序列，难以得到PCR产物，这个办法又失败了！她于是又尝试了各种PCR试剂，摸索了各种PCR扩增条件，终于在2009年，她接手该项研究的第三年，获得了期待中的结果--在凝胶成像仪上清晰地看到从克里斯托弗DNA中扩增出来的不同于其父母和其他正常人的异常条带！经过DNA测序证实，这个异常条带正是研究者向往已久的含有部分9号染色体和部分22号染色体的杂合型DNA序列！也就是说克里斯托弗的22号染色体断裂点也落在了这个22号染色体易位热点上。研究工作取得了重大的进展！
22号染色体易位热点只含有大约600个碱基，参照以往文献报道中以及GENEBANK 公布的22号染色体断裂点周围BAC序列，也只有大约13个千碱基对可供参考。13个千碱基对以外就是所谓的荒岛区（GAP）。由于该GAP含有多个染色体易位热点，各国科学家们已经长期以来对该区进行研究克隆，但由于复杂重复序列不能对之进行扩增测序，只能望洋兴叹。当她拿着这个成功获得的杂合性序列到克雷默博士办公室向他报告时，克雷默博士激动的不知说什么好。他们终于克隆到了这个断裂点。接下来，如果能从将克里斯托弗22号染色体断裂的两端序列加以延伸，就可以知道断裂点究竟是落在一个什么序列上，一个基因还是一个重要的基因调节序列，它的重要意义在于可以填补人类基因组计划的GAP空缺！
带着这个幻想，谭晓晖博士又投入了紧张而兴奋的实验研究中。为了延伸22号染色体断裂的两端序列，她先后与多名在各自研究领域内知名的NIH科学家合作，尝试了多种DNA水平的PCR方法，这些专家包括Developmental Therapeutics Branch研究室主任，Genome Structure and Function Group主任，获得克隆重复序列专利的Vladimir L. Larionov教授等，通过TAR cloning（The transformation-associated recombination）来鉴定22号染色体断裂的两端序列。但是，同样由于该序列的复杂性，这些尝试均告失败。
面对新的失败，经过慎密的思考，失败的原因在哪里？之所以不能进行PCR扩增的是因为复杂的重复序列。那么如何绕开这些重复序列行不行呢？为什么不可以在RNA或蛋白水平探索一下？谭晓晖博士再次为自己的这一新的想法感到兴奋。当她把自己的想法对克雷默博士讲后，克雷默博士建议共同咨询NIH生物信息学专家Medha Bhagwat博士，Medha Bhagwat博士是美国国家生物信息学中心的资深顾问，曾参与构建了NCBI GenBank数据库。经过咨询，根据Medha Bhagwat博士的建议，经过多种生物信息工具分析，他们发现断裂点周围的序列与GAP以外的一个预测基因LOC653203有很高的同源性，也就是说，断裂点周围的序列完全有可能编码基因。
带着疑惑，克雷默博士和本实验室的副主任迪乔瓦尼（John J. DiGiovanna）博士决定共同再次访问肿瘤分子遗传学主任梅尔泽博士。当谭晓晖博士将自己的实验计划讲述给梅尔泽博士后，梅尔泽博士否定了这个做法。他说，这个区域根本就是非编码区这么多的大小重复序列说明根本不可能编码基因，也就是说，根本不能在RNA更不用说在蛋白水平进行扩展。再说，对这个区域的研究已经有相当漫长的历史了，并且都是世界顶尖级的实验室。如果这么容易，那些人早就报道了。克雷默博士和迪乔瓦尼博士听到这个基因组专家的论证，也表示这个方案不切实际，建议终止课题研究，将已经取得的研究结论公开发表。
5 坚韧不拔 终获成功
从梅尔泽博士那里回来以后，虽然这位业界大腕儿专家给出了明确的否定结论，谭晓晖博士内心还是有些不甘心，她仔细比对了已经获得的断裂点周围的序列，发现有些序列还是有编码基因的可能。鉴于该区含有多种重复序列的特性，很可能被染色体易位打断的部位是一个与预测基因LOC653203有很高同源性的新基因。于是她决定自己先悄悄的进行实验，等到拿出明确的结果，再公开自己的看法，她对自己的判断很有信心！于是，她首先按照预测基因LOC653203的外显子序列设计了多对PCR引物对克里斯托弗的RNA-步移PCR扩增，开始的时候还是一无所获，随着实验的深入，有时可以得到一些杂带。又经过对实验条件的反复摸索、调整和枯燥的重复，终于可以从克里斯托弗的RNA中扩增到一些与其父母以及其他正常人RNA不同的产物。她又将这些不同的扩增产物经纯化后测序，最后终于得到了她想要的杂合序列- 一半来自p14ARF基因一半来自22号染色体断裂点周围的序列！这意味着，克里斯托弗易位断裂点周围序列确实是一个可编码基因！经过了漫长的期待和辛勤的劳动，自己的假想终于得到了证实！
当她第二天把克雷默博士带到自己实验室电脑前给他看这个研究结果时，克雷默博士盯着测序图足足几分钟没讲话，然后他激动地突然呼叫研究室副主任：“迪乔瓦尼，快来！” 迪乔瓦尼赶来以后仔细盯着测序图看明白后，大声惊呼一声：“上帝啊”。三人相视欢呼，喜极而泣！随后，克雷默博士回到他的办公室立即给梅尔泽博士打电话说，谭晓晖博士got a wonderful result！
可以想象，对于谭晓晖博士和整个研究组来说，经过了千辛万苦，终于获得预期结果的那一天，该是度过了怎样一个激动的难眠之夜啊！
在此基础上，又经过多种实验终于克隆出一个位于人类基因组测序GAP中的新基因-FAM230A Gene 。他们把这个新基因提交到了美国国家生物信息数据库。接着，谭晓晖博士又克隆出位于克里斯托弗体细胞内的杂合基因和蛋白。并发现了一些新的调节机制。
经过六年不分昼夜的艰苦努力，谭晓晖博士在NIH这个研究平台上，在前人的研究基础上，在数不清的多位顶尖科学家的共同协助下，终于揭开了这个谜团。他们的研究成果最终以《t（9；22）引发p14ARF和TBX1嵌合负调控与黑色素瘤、耳聋及DNA修复缺陷相关性》[1]（Chimeric Negative Regulation ofp14ARF and TBX1by a t（9；22）Translocation Associated with Melanoma， Deafness，and DNA Repair Deficiency）为题，发表在国际知名期刊《人类突变》2013年9期（human mutation）上。这一研究成果，对揭秘生命科学的奥妙做出了贡献。
6 结语
针对一个不常见的病人，科学研究人员应该采取什么样的治学态度呢？从这一课题的研究实践中，体现出了敏锐的探索思维，进而转化为对未知事物的研究行动。广袤无垠的神秘的自然界，不正是在人类的一点一滴的探索中，逐渐揭开了它的面纱吗？！
科学研究工作有它自己的客观规律，科学发现行为本身，是偶然性和必然性的合理结合。锲而不舍的求索过程是最终获得成功的必然先决条件，但是成功的来临经常是偶然促成的，在必然进程中，偶然就会不经意的到来。所以对科学研究行为人为地设定期限，要求在设定的日期内获得结果，这个设定本身就是不科学的。本课题前后用了10多年的时间，数不清的研究人员先后为之努力奋战，因为它的科学意义，课题组无条件地获得了支持，最终取得了成功。试想如果最初的时候要求课题组3年或者5年结题，那只能有一个结果，就是半途而废。
资金支持是研究工作的基础，10多年来，政府对该课题的资金投入达到百万美元以上。对认定的有意义的工作不计投入，有耐心，有信心，营造宽松的学术研究的大环境，让科研人员能够全身心地投入工作，是获得成功的重要的条件。
参考文献：
[1]Xiaohui Tan，Sarah L.Anzick，Kenneth H.Kraemer，etc.Chimeric Negative Regulation ofp14ARFandTBX1by at（9；22）Translocation Associated with Melanoma，Deafness，and DNA Repair Deficiency.HUMAN MUTATION，Vol.34，No.9，1250-1259，2013.
[2]Holmes SE，Emanuel BS，BudarfML，etc.1997.Disruption of the clathrin heavy chain-like gene（CLTCL）associatedwith features of DGS/VCFS：a balanced（21；22）（p12；q11）translocation.Hum MolGenet 6：357-367.
[3]Kehrer-Sawatzki H，Haussler J，Assum G，etc.1997.The second case of a t（17；22）in a family with neurofibromatosis type 1：sequence analysis of the breakpoint regions.Hum Genet 99：237-247.
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