金黄色葡萄球菌在蔬菜中生长状况分析

学生在学校小卖部就餐，发生一起食物中毒事件，共4名学生发生食物中毒，经证实为一起产A型肠毒素金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件；2009年9月广西柳州地区民族高中部分师生及周边居民50多人发生食物中毒事件，“罪魁祸首”已经确定，致病菌为金黄色葡萄球菌；2011年5月8日宁夏永宁县一场婚宴上数十名群众先后出现恶心、呕吐、腹泻等症状，疑似食物中毒，经鉴定引起这次中毒事件的为纽波特沙门氏菌和金黄色葡萄球菌；2012年3月江苏省江阴市某中学食堂发生一起240人细菌性食物中毒事件，经流行病学调查分析和实验室病原菌检验，并结合患者临床症状，证实这是一起由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒事件；2013年9月26日江苏省苏州市食品安全办公室对市区市场蔬菜、肉及制品、乳制品、蛋及蛋制品、大米、水果、水产品、熟食卤菜等33大类进行抽检，在盒饭、熟食卤菜中检出金黄色葡萄球菌。

3 暴露评估

3 1 在种植的环境下暴露

（1）菠菜种植地以及周边环境的污染是引起菠菜种植过程中感染金黄色葡萄球菌的主要原因。环境的污染主要是指肥料和水源的污染。金黄色葡萄球菌通过污染施肥用的粪便或灌溉用水间接感染菠菜。（2）种植人员患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）等疾病，却不加注意卫生，造成间接感染。（3）菠菜采摘人员在上完厕所后未洗手就去采摘菠菜、雨水将排泄物从饲养动物的农场冲到菠菜种植地里等均为金黄色葡萄球菌的繁殖提供了条件。

3 2 在流通过程中的暴露

菠菜在流通过程中主要通过2种渠道进入到消费者手中：（1）菠菜在流通过程中作为原料，从种植区运送到蔬菜产品加工厂后，没有立刻进行加工，也没有放入冷库低温冷藏，造成金黄色葡萄球菌繁殖；在工厂中的加工过程是决定菠菜产品质量和安全的重要环节，工厂内部的各环节人员健康状况、环境卫生情况、工艺控制、交叉污染情况等都容易造成菠菜产品受金黄色葡萄球菌的污染；在运输和销售过程中包装不严、运输和销售人员自身带菌、运输车辆和用具被金黄色葡萄球菌污染等均可间接污染蔬菜产品，产生肠毒素，引起食物中毒；在餐馆、路边小吃摊等环境卫生条件差的地方就餐，厨师等接触到菠菜的人员在烹调菠菜前，未对手和刀、砧板等用具进行消毒并且制备食物时生熟食品未分开加工，生熟用具也未分开使用；菠菜在烹饪前清洗不干净或者焯过菠菜的水又作为饮用或烹饪用水，造成金黄色葡萄球菌污染。（2）从种植地采摘的新鲜菠菜未进行任何加工，直接贩卖到消费者手中。消费者在烹饪菠菜前，手、菠菜和厨房用具未进行消毒，菠菜在烹饪过程中加热不完全，手又接触餐具等造成厨房与就餐区域被金黄色葡萄球菌污染。

图1展示了从菠菜生长到最后食用可能会感染S aureu的过程：原料菠菜中的浓度→加工过程中的变化→贮藏过程中的变化→消费的剂量→消费时摄入的剂量。

如表1所示，通过对河北省保定市及周边地区的菠菜种植产地、生产加工企业以及市场、超市等场所采集的325份菠菜样品，按照国标检验方法对325份菠菜样品进行金黄色葡萄球菌检测，结果检出率达16 3%；同时利用mini VIDAS检测仪对阳性样品进行肠毒素的检测，结果阳性率为56 6%。 鉴于该菌的广泛存在及传播可以对菠菜造成污染，因此，将金黄色葡萄球菌确定为菠菜中的特征性致病菌对其进行风险评估研究。

3 3 采用蒙特卡洛法建立菠菜中金黄色葡萄球菌的预测模型

称取200 g经致病菌检测结果为阴性的新鲜菠菜分别置于灭菌大烧杯中，接种菌数为103～104 CFU/mL 的S aureu菌悬液5 mL，充分混合，用灭菌的纱布封口，注意所有的操作在生物安全柜中进行。将盛有样品的烧杯分别置于4、10、15、20、25 ℃恒温储藏，4 ℃条件下每隔24 h检测1次S aureu的生长情况；10、15、20 ℃条件下每隔12 h检测1次，25 ℃条件下每隔6 h检测1次，每条生长曲线至少检测10个点以上。每个温度条件下的样品均做2组平行。

参考GB 4789 10—2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》 [7]的方法，采用Baird-Parker平板和3M金黄色葡萄球菌快速测试片分别对在菠菜上生长一定时间的金黄色葡萄球菌进行计数。并用SN/T 1869—2007《食品中多种致病菌快速检测方法PCR法》 [8]中的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法代替生化鉴定试验中的血浆凝固酶试验。

利用蒙特卡洛法将测定的生长曲线数据分别拟合 Gompertz 方程、Logistic 方程、Richards方程和Linear方程建立生长模型。通过对Gompertz、Logistic、Richards、Linear这4种模型的标准差s和相关系数r比较，确定最适模型；再由最适生长模型计算出金黄色葡萄球菌的生长参数 [9-11]。

将模拟的4 种模型的标准差（s）和相关系数（r） 进行比较，10 ℃时Linear模型的标准差最小、相关系数最大，拟合性也较其他3个模型好，这是因为在低温条件下微生物生长缓慢。15、20、25 ℃条件下 Gompertz 模型的标准差最小、相关系数最大，拟合性也最好，其次是Logistic模型，而Linear模型的拟合性最差。由此说明，在温度较低的情况下应该选择 Linear 模型进行拟合。随着温度的升高，迟滞期（Lag）变短，最大生长速率（μmax） 变大，因此加工企业可以通过这些生长参数对整个加工流程的时间进行控制，降低金黄色葡萄球菌对食品造成污染的概率。4 ℃时，金黄色葡萄球菌几乎不生长，不能进行拟合。

Gompertz方程的数学描述为：

L（t）=A+Cexp{-exp[-B（t-M）]}。

式中：L（t）为菌数自然对数值（ln CFU/g）；A为初始菌数自然对数值（ln CFU/g）；C为细菌最大生长量自然对数值（ln CFU/g）；M为细菌生长率最大时对应时间（h）；t为时间（h）；B为M时刻生长率自然对数值[ln CFU/（g·h）]。

Linear方程的数学描述：

y=μmaxt 。

其中，t为时间（h）；μmax为微生物生长的最大比生长速率（h -1）。

通过最适生长模型计算出金黄色葡萄球菌的迟滞期（M）、最大生长速率（B）以及相对最大细菌浓度（A）。由表3可以看出，随着贮藏温度的升高，B逐渐增加，而M则逐渐减小。

对于二级模型的建立，这里采用二级响应面方程（多项式[CM（25]方程），以自然对数的方式进行结合。应用二级响应面方程，对一级模型中参数B和M的对数形式建立二级模型，形式如下（图2、图3）：

lnB=6 106+1 178x+1 780x2（r=0 999）；

lnM=2 990-4 403x+8 690x2（r=0 996）。

由图2和图3可以看出，随着温度的升高，一级模型中生长速率逐渐增大，但是增长的幅度慢慢减小；迟滞期M逐渐减小，证明达到最大生长速率的时间逐渐缩短，降幅也逐渐变小。

4 风险特征描述

菠菜含有丰富的维生素A、维生素C及矿物质，尤其维生素A、维生素C含量是所有蔬菜类之冠，人体造血物质铁的含量也比其他蔬菜多，对于胃肠障碍、便秘、痛风、皮肤病、各种神经疾病、贫血有特殊食疗效果，对解酒毒及防止齿槽脓漏现象亦具有食疗效果。本研究采集了各种可能的食用菠菜样品，进行了感染S aureus的比例检测，结果表明市场上还是流通着很多感染S aureus的蔬菜，下面就上述的危害识别、暴露评估等分析菠菜中S aureus的风险特征。

金黄色葡萄球菌是抵抗力最强的无芽胞菌之一，在环境中广泛分布，是人类的正常菌丛成分，有时附着于皮肤，特别是寄居鼻腔，成为住院病人发生感染的显著危险因素，是常见的化脓性球菌，寄生在大多数人的皮肤上，常引起皮肤、软组织感染，细菌可侵入淋巴管及血液，引起危及生命的败血症及严重的转移性感染如心内膜炎、关节炎、骨髓炎、肺炎、脑膜炎等。某些金黄色葡萄球菌可产生毒素，引起皮疹或多系统功能障碍，如中毒性休克综合征。根据上述的预测模型预测菠菜在不同温度环境下S aureus菌的增长系数，从而估计菌量，减少食用量，达到预防S aureus菌及其毒素对身体影响的目的。金黄色葡萄球菌的易感人群主要是有创口的外科病人、严重烧伤患者、新生儿、老年人、免疫缺陷者、血液病、恶性肿瘤及糖尿病患者，或患流感、麻疹伴肺部病变者；病后免疫力不强，可反复感染；其中31～40岁感染率最高，其次是21～30岁年龄段，而男性的感染率要高于女性。

通过HACCP风险分析研究后发现，若在菠菜的种植、加工、销售和食用中监管不严或处理不当，就会导致感染金黄色葡萄球菌的几率增大。直接食用的菠菜应在低温和通风良好的条件下贮藏，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，冷藏或通风阴凉的地方放置菠菜也不能超过6 h，在食用前要彻底加热。在菠菜加工过程中要定期对其生产加工人员进行健康检查，患金黄色葡萄球菌疑似症状的人员要调换岗位或暂时停止其工作。在整个过程中，如果不能对菠菜的质量安全进行控制，导致金黄色葡萄球菌大量繁殖，并产生肠毒素，虽然彻底蒸煮会杀灭金黄色葡萄球菌，但由于肠毒素的耐高温性，食用后仍会发生金黄色葡萄球菌中毒的情况。此外，无论冷冻菠菜的生产过程如何，菠菜中S aureus的初始浓度也是引起风险的最根本因素和敏感性分析中很大的风险因素，因此从源头上控制该菌的初始浓度是最为有效的预防措施。

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