胃癌患者呼出气冷凝液及肿瘤组织中P53蛋白的检测

对照正常胃标本切片中的P53蛋白表达水平，采用免疫酶法检测胃癌呼出气体P53蛋白的水平，采用SPSS19.0统计软件分析P53蛋白检测阳性率。 结果 胃癌手术后肿瘤标本切片中P53阳性率为60.6%，肿瘤标本切片阳性高于对照组（P<0.01）；胃癌患者呼出气体中P53蛋白浓度为（50.81±14.25） ng/L，胃癌患者比正常对照组高（P<0.01）；Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期胃癌患者EBC中P53蛋白浓度较Ⅰ期高；胃癌组织中P53蛋白检测的敏感性和特异性为60.7%和90.0%，EBC中为42.4%和93.4%，两种检测途径无显著性差异（P>0.05）。 结论 胃癌组织及EBC中P53蛋白检测可用于胃癌的辅助诊断及病情监测。

[关键词] 胃癌；P53蛋白；呼出气冷凝液；肿瘤组织

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）18-0009-03

胃癌是最常见的人类恶性肿瘤之一[1-2]，我国胃癌的发病率为23.96/10万，目前胃癌的发病率呈上升趋势。由于胃癌早期诊断较为困难，存活率一直较低。胃癌患者标本切片检测在胃癌的早期诊断、病情程度判断、胃癌治疗疗效评价、胃癌转移和复发的治疗以及预后估计等方面起重要作用。胃癌患者呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）检测方法[3-4]是一种新的无痛无创呼吸道呼出气体的方法，具有无痛收集容易、患者易接受、可重复进行等优点。检测EBC中胃癌肿瘤标志物，或许是找到胃癌早期筛查的一种新途径。肿瘤抑癌基因p53在肿瘤的发生机制中起重要作用，通过对66例胃癌患者肿瘤切片及患者呼出气冷凝液（EBC）中P53蛋白表达水平研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

采用回顾性分析，根据有无胃癌疾病分类[5]将研究对象分为胃癌组66例和健康对照组60例。胃癌组66例均选自2010年1月～2015年12月浙江省肿瘤医院住院患者，胃癌患者均经手术方式，临床免疫组化结果诊断为胃癌，其中男52例，女14例，年龄40～80岁，平均60岁。

1.2 病理分型

腺癌44例，鳞癌22例。66例胃癌患者按照全球抗癌联盟2009年制定的TNM分期标准进行分期[6]，Ⅰ期44例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例，Ⅳ期2例。选取本科门诊体检健康者60例作为对照组。其中男42例，女18例，年龄30～80岁，平均60岁。胃癌组和对照组排除严重心肝肺功能疾病、心脑血管等慢性疾病。胃癌标本切片和健康正常对照组性别、年龄对比无统计差异[7]。

1.3 标本收集和处理

研究胃癌患者呼出气冷凝液收集采用EcoScreen冷凝器采集，测试者漱口，单鼻子平静呼吸气体，呼出气在-25℃收集管中，可冷凝变为霜状物，35 min后，拔出收集管融化后可收集到3 mL左右呼出气冷凝液，装入真空无菌试管内，置于-80℃冰箱内保存，检验时解冻。呼出气冷凝液收集前2 h，不做肺活量检查和运动，收集保证测试一次完成，以避免影响检测结果。收集我院病理科胃癌患者的石蜡切片，病理明确胃癌的为测定组，取肿瘤远端4 cm 以外经病理，显微镜检查没有癌细胞的胃组织作为正常对照组。

1.4 检测方法

1.4.1 采用免疫组化（SP）法检测肿瘤蛋白 胃癌切片和肿瘤远端4 cm以上无癌组织中P53蛋白的检测[8-9]结果判定：颜色为棕黄和棕褐色，P53蛋白表达为阳性。位于细胞中分析；P53蛋白表达阳性细胞的计算数：每个标本随机选取15个高倍显微镜，计算数2000个细胞，阳性细胞百分率，阳性细胞百分率≥30%为阳性，<30%为阴性，是按照国际病理阴阳性计数标准计分[10-11]。

1.4.2 采用免疫酶法检测 呼出气冷凝液中P53蛋白采用免疫酶法，正常组检测平均值加2.5倍的标准差为正常参考值水平， EBC中 P53<60.03 ng/L。

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0统计软件分析。胃癌切片组和健康对照组P53蛋白检测阳性表达比较，使用χ2检验；胃癌切片组和对照组EBC中P53蛋白水平，几种类型胃癌P53蛋白水平比较，采用t检验；四种分期胃癌EBC中P53蛋白表达量比较，采用t检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌肿瘤标本切片中P53蛋白表达

P53蛋白免疫组化染色阳性信号为棕黄色颗粒，主要定位于细胞核。见封三图2。

2.2 胃癌组肿瘤切片及EBC中P53蛋白表达水平

见表1、2。本组研究结果显示，P53蛋白在胃癌患者肿瘤切片中的表达阳性率为60.6%（40/66），胃癌组比对照组高（P<0.01），在Ⅰ期和Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期的阳性表达率分别为63.6%和54.5%，P53蛋白在胃癌不同病理类型及不同病理分期表达差异均无统计学意义。胃癌组EBC中P53蛋白的含量为（50.81±14.25）ng/L，对照组为（33.69±12.17）ng/L，胃癌组较对照组高（P<0.01）；在鳞癌和腺癌EBC中P53蛋白的水平分别为（50.31±14.25）ng/L、（51.63±13.97）ng/L，两者比较无统计学差异（P>0.05）；Ⅰ期和Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期胃癌EBC的P53蛋白的水平分别为（47.06±7.11）ng/L、（58.33±21.38）ng/L，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 肿瘤组织与EBC中P53蛋白检测的敏感性、特异性

见表3。胃癌组肿瘤组织中P53蛋白检测的敏感性和特异性为60.7%和90.0%，EBC中为42.4%和93.4%，两种检测途径无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

生物体内一种抑制细胞转变癌细胞的基因，p53是主要抑癌基因。细胞中癌基因可分为致癌基因（oncogene）和抑癌基因，只要一方突变转变，癌变可能会发生。人类p53基因在17号染色体p13，全长16～20 kb，由11个外显子组成，合成转录2.8 kb的mRNA，转录成蛋白质为P53，为细胞核内磷酸化蛋白。截止目前研究人类肿瘤相关性最高的基因是p53基因，过去一直认为p53是一种癌基因，1989年几位学者研究起癌基因作用的是突变的p53，后来证实抑癌基因是野生型的p53[12-14]。P53蛋白由393个氨基酸残基构成，在细胞内以四聚体的形式存在，凋亡期为20～30 min。正常情况下，细胞中P53蛋白的含量很低，因其半衰期短，所以很难检出来，但在生长增值的细胞中，可升高10～100倍以上。维持细胞正常生长发育和抑制恶性增殖中野生型P53蛋白起着重要作用，因而被称为“基因卫士”的称号。p53基因控制细胞染色体DNA的完整性，如果细胞中染色体DNA遭到损害，P53蛋白和基因的DNA的相应结合部位结合，起特殊转录因子的作用，激活p21基因合成转录，细胞转录停滞于G1期；解链酶的活性被抑制；并与复制因子A相互作用，控制DNA的复制和修复。如果修复重组失败，P53蛋白开动程序性凋亡过程诱导细胞自杀，癌变倾向的突变细胞生成被阻止，细胞恶变得到控制。p53基因突变后，细胞构象影响到转录编译功能和P53蛋白的磷酸化过程，野生型p53抑制肿瘤增殖的作用将失去，此时突变基因具备癌基因的功能。突变的和野生的P53蛋白相结合，合成的这种异类蛋白不能结合DNA，致癌基因转录失控导致肿瘤发生。目前主要通过胃癌组织、血液和痰标本等检测p53基因的变异，而通过EBC检测p53基因突变是最近的研究报道，有研究报告EBC中检测p53基因变异率为35.4%[15-16]。

P53蛋白在胃癌切片中表达和临床病理研究关系，大部分人认为P53蛋白可作为胃癌预后的一项指标[17-18]。有研究发现P53蛋白在胃癌患者的肿瘤组织中表达阳性率为55%[19]，胃癌患者没有采取放化疗，P53蛋白表达为阳性，存活期阴性比阳性长，两者有统计学差异，表明胃癌肿瘤组织中P53蛋白的表达与患者的预后相关[20]。本研究显示，P53蛋白在胃癌患者肿瘤切片中表达阳性率为60.6%（40/66），胃癌切片组高于对照组（P<0.01），Ⅰ期和Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期的阳性表达率分别为63.6%和54.5%，不同病理类型及不同病理分期P53蛋白表达无显著性差异。目前对于EBC中P53蛋白的检测报道较少，我们研究显示胃癌组EBC中P53蛋白的水平显著高于正常对照组（P<0.05），在不同病理类型EBC中P53蛋白的水平无显著性差异，Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期EBC中P53蛋白的表达水平高于Ⅰ期（P<0.05）。通过肿瘤组织及EBC两种检测途径对P53蛋白的表达进行检测，敏感性及特异性无显著性差异，提示肿瘤组织及EBC中P53蛋白检测可作为胃癌诊断，病情判断和评价预后的指标。

有研究表明胃癌患者突变型p53蛋白高表达，DNA修复能力减弱[21]。胃癌的发生和转移与突变型p53蛋白密切相关。胃癌肿瘤标本及EBC中P53蛋白检测对胃癌的诊断有临床研究意义，对于胃癌分期、治疗效果评价和预后估计也是值得今后进一步研究的课题。

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（收稿日期：2016-02-20）

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