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摘 要 从文昌椰子园土壤分离筛选到一株对椰子泻血病菌奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa）有良好抑制效果的放线菌FXJ-258，对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析。结果表明：该菌孢子方形至长圆形，表面光滑，在高氏培养基上，气丝初期白色，随着时间渐变为浅灰色，基丝无鉴别色素，无可溶性色素;能利用L-阿拉伯糖，D-半乳糖， D-葡萄糖，D-甘露糖，D-木糖，D-核糖，L-鼠李糖等碳源，不能利用D-果糖，肌醇，蔗糖，水杨苷等。以16S rDNA序列为基础构建了菌株FXJ-258的系统发育树，其与模式链霉菌株的16S rDNA序列的同源性为99.64%，初步将该菌株鉴定为Streptomyces murinus。
关键词 鼠灰链霉菌;筛选;椰子泻血病;拮抗菌
中图分类号 S432.4 文献标识码 A
Identification of a Streptomyces Strain Against Coconut Stem
Bleeding Disease Caused by Ceratocystis Paradoxa
NIU Xiaoqing， YU Fengyu， SONG Weiwei， TANG Qinghua，
ZHU Hui， QIN Weiquan*
Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan
Key Laboratory for Biology of Tropical Oil Crops， Wenchang， Hainan 571339， China
Abstract A streptomyces strain named FXJ-258 against stem bleeding disease caused by Ceratocystis paradoxa was isolated from soil in Wenchang coconut garden. The morphological characteristics， cultural characteristics， physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequences analysis of Streptomyces FXJ-258 were studied. The result showed that，the spores of FXJ-258 were quadrate or ovale， smooth-surfaced. On Gause’s Synthetic Agar medium（GSA）， the substrate mycelia of FXJ-258 was colored that couldn’t be identified， the clone of FXJ-258 was white when it started growing on GSA， after matured， the aerial mycelia of FXJ-258 became gray gradually， couldn"t produce soluble pigment on GSA medium. FXJ-258 grew better on medium with L-arabinose， D-galactose， D-glucose， D-mannitol， D-xylose， D-ribose， L-rhamnose as C source; D-fructose， inositol， salicin and sucrose were not available. Besides， a phylogenetic tree was constructed by comparing with the published 16S rDNA sequence of the related species; ITS sequence analysis revealed 99.64% sequence similarity with Streptomyces murinus. Thus， FXJ-258 was preliminarily classed to S. murinus.
Key words Streptomyces murinus; Screen; Stem bleeding disease of coconut; Antagonistic
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.021
自2009年以来，海南省椰子茎泻血病（Stem Bleeding Disease of Coconut）发病面积逐年增大，现已成为椰子主要病害之一，其病原是奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa）。该病害主要危害椰子茎部，病灶部位流出血色液体，干燥后成铁锈色（图1），当遇到连续阴雨天气，严重时植物组织会坏死，造成茎干腐烂（图2），直至植株死亡。目前生物防治手段是防治该病害的主要途径。印度在该病的生物防治方面做了一些研究，Srinivasulu等[1]报道绿色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（T. harzianum）、哈氏木霉（T. hamatum）对奇异根串珠霉菌（T. paradoxa）有极强的抑制效果;Gowda等[2]报道蒜（Allium sativum Linn.）提取物对奇异根串珠霉菌（T. paradoxa）也有强烈的抑制作用。链霉菌也是一类重要的生防菌，能产生多种农用抗生素，较化学农药，具有选择性强、不易产生抗药性、可再生、环境兼容性好、生产原料广泛等优点，已成为无公害农药发展的方向[3]。笔者从椰子林、红树林土壤分离到大量菌株，从中筛选到一株针对奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa）防治效果较好的链霉菌，编号为FXJ-258。本研究对其进行形态学鉴定、生理生化特性研究及16S rDNA序列分析，并构建系统发育树对该菌株进行初步分类鉴定，该菌FXJ-258室内防治奇异长喙壳菌的报道在国内外尚属首次。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株来源：菌株FXJ-258分离自椰子林土壤，保存于椰子研究所病理实验室。
供试培养基：甘油硝酸盐素琼脂、无机盐淀粉琼脂、葡糖天冬素琼脂、甘油天冬素琼脂、酵母麦芽精琼脂、燕麦粉琼脂、酪氨酸琼脂、高氏一号培养基（GSA）、高氏液体培养基（GS）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、明胶液化、淀粉水解、牛奶凝固、黑色素产生、硝酸盐还原、纤维素分解、碳源利用等，配置方法见《链霉菌鉴定手册》[4]。
1.2 方法
1.2.1 拮抗菌的筛选 采用平板对峙法，筛选拮抗菌株。在PDA平板中央接上椰子泻血病菌菌饼（Φ=6 mm），菌饼两端接上放线菌块，有抑菌带出现，视为有拮抗作用。抑菌圈大小测定，采用十字交叉法，在平板（Φ=9 cm）四周等距离接4株病原菌饼（Φ=6 mm），平板中央接放线菌，于28 ℃培养。每处理重复3次。以中央只接病原菌，不接放线菌平板为对照。待对照菌株长满培养皿后，测量抑菌圈直径，观察放线菌的抑菌效果。
1.2.2 链霉菌菌株FXJ-258的形态学、生理生化特性研究 选取筛选到的拮抗菌株FXJ-258，采取插片法，利用显微镜观察菌丝形态;根据《链霉菌鉴定手册》[5]推荐的培养基，观察基内菌丝，气生菌丝和可溶性色素的颜色等表观特征， 3次重复;配制明胶液化、淀粉水解、牛奶凝固、黑色素产生、硝酸盐还原、纤解、碳源利用等固体、液体培养基，测定菌株FXJ-258的生理生化特性，3次重复。
1.2.3 链霉菌菌株FXJ-258 16 S rDNA序列分析
参照Kieser等[5]方法提取该菌株基因组DNA。选用链霉菌16 S rDNA的通用引物：Primer A：CATTCACGGAGAGTTTGATCC和Primer B：AGAA
AGGAGGTGATCCAGCC进行扩增，扩增产物送往上海生物工程技术有限公司进行测序。将得到的16 S rDNA序列与GenBank中的已有序列进行Blast比对分析，按照16 S rDNA序列同源性高低，选取模式菌株序列，构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 拮抗菌的分离筛选
筛选结果显示FXJ-258拮抗效果较好，抑菌圈直径达到3.5 cm。图3为拮抗效果图，可见产生的抑菌圈与菌丝的界线明显，光滑，无菌丝扩展出来。
2.2 链霉菌菌株FXJ-258形态学、生理生化特性鉴定
该菌在高氏一号培养基上，灰白色，圆形，平坦，如图4所示，在液体高氏一号培养基内28 ℃，150 rpm，摇7 d，菌体圆球形，光滑（图5）。 该菌孢子方形至长圆形，表面光滑或带疣，菌丝有分支多呈锐角或直角（图6）。
FXJ-258生理生化结果显示：菌株FXJ-258能使明胶稍微液化，牛奶凝固和胨化可疑，淀粉水解能力弱，不能水解纤维素，不产生H2S和酪氨酸酶和黑色素，有硝酸盐还原反应，不形成黑色素;FXJ-258在各培养基上的孢子丝生长情况及可溶性色素情况见表1，表1同时显示了与近缘种Streptomyces murinus，S. costaricanus，S. graminearus，S. griseofuscus的比较结果[6]。
FXJ-258能利用L-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-木糖，D-核糖，L-鼠李糖等碳源，不能利用D-果糖，水杨苷、蔗糖、肌醇等多种物质，详见表2，表2同时显示了FXJ-258与近缘种Streptomyces murinus，S. costaricanus，S. graminearus，S. griseofuscus的比较结果。
2.3 链霉菌菌株FXJ-258 系统发育树分析
菌株FXJ-258 16S rDNA PCR扩增片段经测序，共1 320 bp，在GenBank中，与已有序列进行Blast比对分析。结果表明：FXJ-258与S. murinus，S. costaricanus，S. graminearus，S. griseofuscus序列同源性最高，相似度高达99.64%。根据16S rDNA序列同源性高低选择模式菌株的序列，利用Megalign子软件做列阵分析，用Phylogenetictree命令做系统发育树（图7）。从图7中可以看出，菌株 FXJ-258与S. costaricanus，S. graminearus，S. murinus，S. griseofuscus归为一簇，亲缘关系比较近。
综上所述，结合形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，可将菌株FXJ-258初步确定为老鼠灰链霉菌S. murinus。进一步确定有待于做Western-blot 杂交实验。
3 讨论与结论
目前，椰子茎泻血病已成为海南椰子的重要病害，近年来发展迅速，严重影响了椰树的观赏和经济价值。当前还没有长期有效的化学农药能弥补因此病害而造成的损失，抗病品种和生物防治也刚刚起步。从生态安全角度出发，生物防治具有更广阔的前景，其中拮抗放线菌是具有巨大研究价值的一类微生物，其应用是生物防治必备的手段之一。海南具有得天独厚的地理环境，微生物资源丰富、种类繁多，为放线菌的筛选提供了良好的物质基础，迄今已知的抗生素中有2/3由放线菌产生，利用放线菌的抗生素制备的农药已经成为无公害农药的主体[7]。据国内报道，以奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa）为靶标而筛选出的拮抗放线菌为浅灰链霉菌（Streptomyces griseolus）[8]，其他拮抗菌株尚未见鉴定研究。
本研究通过菌株16S rDNA序列分析和构建系统发育进化树等分子生物学方法对FXJ-258进行了分类鉴定，结果显示，FXJ-258属于Streptomyces costaricanus，S. graminearus，S. murinus，S. griseofuscus中的一种，因此要进一步结合形态学、培养特征和生理生化特性等方面的异同方可将其初步鉴定到种。该菌在甘油天冬素琼脂，酵母麦芽精琼脂，燕麦粉琼脂培养基上，气丝灰色至灰红色，基丝无鉴别色素，可溶性色素为黄色。在无机盐淀粉琼脂、葡萄糖天冬素琼脂上，气丝粉状至灰红色，基丝为黄色;在马铃薯块上，气丝灰色，基丝正面为黄色，可溶性色素无可鉴别色素;能使明胶稍微液化，不确定是否能使牛奶凝固和胨化，淀粉水解能力弱，不能水解纤维素，不产生H2S和酪氨酸酶和黑色素，有硝酸盐还原反应，不形成黑色素，能利用L-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-甘露醇，L-鼠李糖，D-木糖，棉籽糖，D-核糖等多种碳源，不能利用D-果糖，蔗糖，水杨苷等碳源。
将FXJ-258的培养情况与4种模式菌株S. costaricanus，S. graminearus、S. murinus，S. griseofuscus比较可知：在葡萄糖天冬素琼脂上，哥斯达黎加链霉菌S. costaricanus气丝黄灰褐色，反面鲜黄色;灰褐链霉菌S. griseofuscus 呈现灰色，禾粟链霉菌S. graminearus气丝白色带黄色调，S. murinus呈现浅灰色[9]，FXJ-258亦呈现浅灰色与S. murinus保持一致。
将FXJ-258的碳源利用情况与上述4种模式菌株比较可知：FXJ-258能利用棉籽糖，L-阿拉伯糖， D-葡萄糖，D-甘露醇，D-木糖，不利用蔗糖、水杨苷等与S. murinus一致;S. costaricanus不利用棉籽糖、L-阿拉伯糖与FXJ-258不同;S. graminearus不利用阿拉伯糖，利用蔗糖情况可疑，不确定是否利用水杨苷与FXJ-258不同;灰褐链霉菌S. griseofuscus能利用肌醇，利用棉籽糖可疑与FXJ-258不同;综上知，经过碳源利用情况比较和培养特性比较结果，可将FXJ-258初步鉴定为S. murinus。关于鼠灰链霉菌S. murinus拮抗椰子泻血病菌奇异长喙壳菌Ceratocystis paradoxa的研究在国内外均属于首次报道。下一步笔者将继续针对此菌做较深入的探索，比如拮抗稳定性、抑菌机理、生物安全性等方面的研究，进而做田间防效实验，为开发出对奇异长喙壳菌有很好防治效果的生防菌剂打下坚实的基础，为绿色宝岛形象树的美丽健康及高产贡献绵薄之力。
参考文献
[1] Srinivasulu B， Vijay K K K， Lakshmi M V， et al. Biointensive IDM approach against basal stem rot and stem bleeding diseases of coconut[J]. Journal of Plantation Crops， 2006， 34（3）： 502-507.
[2] Gowda P V， NambiarK K N. Antifungal activity of garlic（Allium sativum Linn.）von Hohnel， the pathogen of stem bleeding disease of coconut[J]. Journal of Plantation Crops， 2006， 34（3）： 472-475.
[3] 文采艺， 张 磊， 李洪连. 农用抗生素S024的作用机理的初步研究[J]. 河南农业科学， 2007（7）： 53-57.
[4] 中国科学院微生物所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京： 科学出版社， 1975.
[5] Kieser T， Bibb M J， Buttner M J， et al. Practical streptomyces genetics[M]. Norwich： John Innes Foundation， 2000： 162-170.
[6] Esnard J， Potter T L， Zuckerman B M. Streptomyces costaricanus sp. Nov.， isolated from nematode-suppressive soil[J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1995， 45（4）： 775-779.
[7] 展丽然， 张克诚， 冉隆贤， 等. 农用抗生素筛选模型的发展概述[J]. 微生物学杂志， 2008， 28（6）： 91-94.
[8] 牛晓庆， 余凤玉， 林 茜， 等. 椰子林土壤放线菌的分离及拮抗椰子泻血病菌的鉴定[J]. 热带作物学报， 2012， 33（1）：1-7.
[9] 卢 娟， 夏启玉， 孙建波， 等. 一株拮抗香蕉枯萎病菌的链霉菌分离和鉴定[J]. 热带作物学报， 2011， 32（2）： 278-282.