酶法辅助提取苦皮藤素工艺优化

材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验材料  苦皮藤根皮粉末：苦皮藤采集于陕西省商洛市黑龙口镇，人工剥取苦皮藤根皮，阴凉条件下风干，粉碎机粉碎。

1.1.2  试剂与仪器  试剂：碱性蛋白酶（化学纯）、中性蛋白酶（化学纯）、胃蛋白酶（化学纯）、纤维素酶（化学纯），北京索莱宝科技有限公司;氢氧化钠（分析纯）。仪器： 全自动固液萃取仪（型号：B-811，步琦实验室设备贸易（上海）有限公司）、电子天平（型号：BSA223S，上海智泰电子科技有限公司）、恒温水浴锅（型号：HH-S，北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  苦皮藤素的提取  参考文献[2，6]的提取方法，称取10.00 g苦皮藤根皮粉末，置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL磷酸缓冲液煮沸5 min后过滤，以除去材料中的氧气。向滤渣中加入酶液，在最适温度水浴保温静置2 h，分别对苦皮藤根皮进行酶解，然后酶失活后过滤，在滤渣中加入甲醇进行提取，60 ℃提取6 h，浸提3次，过滤收集滤液，蒸发器处理滤液，称苦皮藤素质量。

1.2.2  酶的筛选  在提取所得的滤渣中加入100 mL磷酸缓冲液，按照表1加入酶液，用0.1 mol/L盐酸溶液和0.1 mol/L氢氧化钠调节pH，在最适温度水浴静置2 h，分别对苦皮藤根皮进行酶解、提取，选择得率最高的酶用于后续试验。

1.2.3  酶法辅助提取单因素试验  以苦皮藤素得率作为评价指标，分别对酶解pH（1、2、3、4、5）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）、酶解温度（27、37、47、57、67 ℃）和加酶量（22 000、44 000、66 000、88 000、120 000 U/g）进行单因素试验，以确定各因素的影响效果和最适范围。

1.2.4  酶法辅助提取正交试验  在单因素试验基础上，以酶解温度、酶解时间、酶解pH、加酶量作为考察因素，以苦皮藤素得率为考察指标，通过4因素3水平正交试验（表2），进一步优化提取工艺参数。

1.2.5  苦皮藤素得率计算  将干燥后的苦皮藤素称质量，计算得率，苦皮藤素得率（%）=苦皮藤素（g）/苦皮藤根皮样品的质量（g）×100。

2  结果与分析

2.1  酶种类的选择

在4种酶中，胃蛋白酶和碱性蛋白酶对苦皮藤素有较好的辅助提取效果，苦皮藤素得率分别为4.5%和4.2%，中性蛋白酶和纤维素酶辅助提取效果较差，得率分别为3.25%和3.16%（图1），因此，选定胃蛋白酶为苦皮藤素辅助提取所用酶。

2.2  单因素试验结果

2.2.1  酶解pH对提取效果的影响  在酶解温度37 ℃、加酶量22 000 U/g、酶解2 h条件下，不同pH所得苦皮藤素得率结果见图2，pH 2对辅助提取苦皮藤素有较好的效果。

2.2.2  酶解温度对提取效果的影响  在酶解2 h、加酶量22 000 U/g、pH 2条件下，不同酶解温度所得苦皮藤素得率结果见图3，37 ℃对辅助提取苦皮藤素有较好的效果。

2.2.3  酶解时间对提取效果的影响  在酶解温度37 ℃、加酶量22 000 U/g、pH 2条件下，不同酶解时间所得苦皮藤素得率结果见图4，酶解5 h对辅助提取苦皮藤素有较好的效果。

2.2.4  加酶量对提取效果的影响  在酶解温度为37 ℃、时间2 h、pH 2条件下，不同加酶量所得苦皮藤素得率结果见图5，加酶量44 000 U/g对辅助提取苦皮藤素有较好的效果。

2.3  正交试验结果

以单因素试验结果为基础，采用正交试验优化胃蛋白酶辅助提取苦皮藤素工艺中的酶解时间、酶解温度、加酶量和pH 4种因素。从表3可知，各因素对酶法辅助提取的影响效果为B>A>C>D，即酶解温度对提取影响较为明显，其次是酶解时间、加酶量和pH，试验最佳组合为A3B2C3D2，即酶解5 h，酶解温度37 ℃，加酶量为66 000 U/g，酶解pH 2时，酶法辅助提取苦皮藤素得率为5.12%。

3  小结与讨论

在环境越来越受到人们关注的21世纪，对病虫害治理，人们一直在寻找对人畜无害或低毒的植物源杀虫剂，可以替代有害残留的化学药剂，许多植物次生代谢物质对农业害虫具有毒杀等生理学功能。较早就以苦皮藤为原料，提取分离出具有杀虫活性的苦皮藤素[7，8]，后续对其提取及工艺、杀虫机理等都展开了一系列研究，尤其以吴文君等[9，11]、张继文等[10]以浸提、层析等分离技术对苦皮藤素化合物展开的研究较为深入，后续也有以回流提取[12]、浸渍提取方法[2]的展开，但酶法辅助提取苦皮藤素的工艺鲜见报道。

酶法辅助提取过程中酶解pH、时间、温度及加酶量对苦皮藤素得率具有影响。通过单因素试验与正交试验表明，在酶解5 h，酶解温度37 ℃，加酶量为66 000 U/g，酶解pH 2时，酶法辅助提取苦皮藤素得率最大为5.12%。虽然酶法辅助提取没有复杂的操作过程，但酶的成本较高，与传统回流提取方法[12]并无明显差异，出现这种可能有多种因素，提取过程中苦皮藤素可能被酶解，酶解pH可能导致苦皮藤素溶解性降低等，因此，探索更加高效的苦皮藤素提取方式将是后续研究的重点。

参考文献：

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[5] 王国亮，南  蓬，龚复俊，等.昆虫拒食剂新资源—苦皮藤果油的化学成分研究初报[J].武汉植物学研究，1989，7（3）：301-302.

[6] 李红娇，李巨秀，赵  忠.酶法辅助提取山杏种皮黑色素工艺优化及其稳定性[J].食品科学，2016，37（10）：69-75.

[7] WAKABAYASHI N，WU W J，WATERS R M，et al. Celangulin：A nonalkaloidal insect antifeedant from chinese bittersweet，celastrus angulatus[J].Journal of natural products，1988，51（3）：537-542.

[8] 刘慧霞，吴文君，王美珍.苦皮藤根皮的红外光谱特征及其在鉴别中的应用[J].西北植物学报，1988，18（2）：305-310.

[9] 吴文君，王明安，朱靖博，等.杀虫植物苦皮藤毒杀成分的研究[J].有机化学，2002，22（9）：631-637.

[10] 张继文，吴文君，田  暄.苦皮藤素类似物的合成與结构鉴定[J].农药学学报，2004，6（3）：21-25.

[11] 吴文君，胡兆农，刘惠霞，等.苦皮藤主要杀虫有效成分的杀虫作用机理及其应用[J].昆虫学报，2005，48（5）：770-777.

[12] 黄四平，杨  光，王小利，等.苦皮藤素的提取、鉴定与杀虫效果实验研究[J].应用化工，2015，44（12）：2193-2198.

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